mRNA加帽工具：cellscript加帽試劑盒

1970年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了mRNA的5’端結(jié)構(gòu)——帽子結(jié)構(gòu)（m7GpppN），它一方面保護(hù)mRNA使其具有穩(wěn)定性，另外一方面，5′端帽子還是前體mRNA剪接、多聚腺苷酸化及和核輸出的標(biāo)識符。同時，mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)如果出現(xiàn)異常，將會引起細(xì)胞發(fā)生抗病毒反應(yīng)。因此，RNA加帽和mRNA的擴(kuò)增，促進(jìn)了mRNA的大規(guī)模生產(chǎn)，mRNA疫苗成為可能。

一、mRNA加帽原理

真核生物mRNA加帽需要在TPase、GTase、N7 MTase等酶的參與下合成帽子結(jié)構(gòu)，原理如下：

（1）RNA三磷酸酶（TPase）從5’-三磷酸中去除 γ-磷酸，生成 5’-二磷酸 RNA

pppN1(p)N.-OH(3')→ ppNi(pN)x-OH(3')+Pi

（2）RNA 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶（GTase）通過賴氨酸-GMP 共價中間體將 GMP 基團(tuán)從 GTP 轉(zhuǎn)移到 5’-二磷酸

ppN1(pN)x-OH(3')+GTP→G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+PPi

（3）嘌呤-N7 甲基轉(zhuǎn)移酶（鳥嘌LING-N7 MTase）在鳥嘌LING帽的N7胺上添加一個甲基，形成基本帽結(jié)構(gòu)（Cap0）

G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+AdoMet → m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+ AdoHyc

（4）m7G 特異性 2’O-甲基轉(zhuǎn)移酶（mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase）還可將核糖2’O位置的核糖核苷酸甲基化生成Cap1結(jié)構(gòu)

m7GpppN1(pN)x-OH(3')+AdoMet → m7Gppp[m3'-o]N1(pN)x-OH(3')+ AdoHyc

                                        Cap 0 RNA                                               Cap 1 RNA

二、RNA加帽酶的應(yīng)用

1. 促進(jìn)靶蛋白的表達(dá)

mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，因此，將mRNA導(dǎo)入細(xì)胞，促進(jìn)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。

2. 促進(jìn)Cap0/Cap1的RNA合成

根據(jù)上述mRNA的加帽原理，合成Cap0/Cap1結(jié)構(gòu)的mRNA。

3. 合成mRNA疫苗

只要獲取致病因子的序列，在RNA加帽酶和RNA自擴(kuò)增技術(shù)下，合成mRNA疫苗。對比于減毒疫苗，mRNA疫苗不會對載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；對比于DNA疫苗，mRNA疫苗無需轉(zhuǎn)錄直接翻譯成蛋白質(zhì)，反應(yīng)時間更快、作用更有效。

三、加帽方法

1. 酶法加帽

利用上述的加帽原理，即可獲得Cap0/Cap1結(jié)構(gòu)。北京百奧創(chuàng)新科技有限公司提供的CellScript加帽試劑盒（貨號：C-SCCS1710）的反應(yīng)時間短，加帽效率高（接近100%），同類產(chǎn)品可直接交叉使用。

2. 共轉(zhuǎn)錄法加帽

轉(zhuǎn)錄起始，加入帽類似物，轉(zhuǎn)錄本沿著帽類似物延長，轉(zhuǎn)錄完成形成的mRNA就具有帽子結(jié)構(gòu)。